El mismo año, Leonardo realizó estudios anatómicos e intentó clasificar sus innumerables notas. También es la época en que empieza a trabajar en La Gioconda (1503-1506, y después 1510-1515) obra habitualmente considerada como un retrato de Lisa Gherardini o, por el nombre de casada, Monna Lisa del Giocondo. Sin embargo, hay numerosas interpretaciones sobre este cuadro que aún son motivo de debate y discusión.
En 1505, se dedicó a estudiar el vuelo de los pájaros, y es también cuando redacta el Códice sobre el vuelo de los pájaros. A partir de entonces, observaciones, experiencias y reconstrucciones se sucedieron con mucha intensidad. Un año más tarde, el gobierno de Florencia le permitió reunirse con el gobernador francés de Milán, Charles d'Amboise, que lo retuvo con él pese a las protestas por parte de Florencia. Leonardo quedó en medio de disputas entre franceses y toscanos, y fue presionado por el tribunal para que acabara La Virgen de las rocas con su alumno Ambrogio de Predis, mientras se encontraba trabajando en La batalla de Anghiari.
En 1507, Leonardo quedó como único heredero de su tío Francesco, pero los hermanos de Leonardo empezaron un procedimiento para modificar el testamento. Leonardo apeló a Charles d'Amboise y a Florimond Robertet para que intervinieran en su favor;[28] Luis XII regresó a Milán y Leonardo se convirtió de nuevo en el organizador de las fiestas que se celebraban en la capital lombarda.
En 1508, vivió con el escultor Giovanni Francesco Rustica en casa de Piero di Braccio Martelli, en Florencia, pero luego se marchó y se fue a vivir a Milán, en la Porta Orientale, en la parroquia de Santa Babila. Luis XII volvió pronto a Italia y en mayo de 1509 entró en Milán. Pronto dirigió sus ejércitos contra Venecia y Leonardo siguió al rey en calidad de ingeniero militar, y asistió a la batalla de Agnadel.[11] En 1511, murió el gobernador Charles d'Amboise y, en 1512, tras la batalla de Rávena, Francia se marchó del territorio italiano. Este segundo período milanés le permitió a Leonardo profundizar en sus investigaciones de ciencia pura. En 1509, la aparición de De expendentis te fugiendis rebus de Giorgio Valla tuvo una gran influencia sobre él.
En septiembre de 1513, Leonardo da Vinci se fue a Roma, donde trabajó para el papa León X, miembro de la rica y poderosa familia de los Médicis. En aquellos momentos, en el Vaticano, Rafael y Miguel Ángel tenían mucho trabajo.[7] Ante el éxito de Sangallo, Leonardo no recibió más que encargos modestos y parece que no participó ni en la construcción de las numerosas fortalezas romanas, poco relevantes, y ni en el embellecimiento de la capital. Tampoco tuvo éxito su pintura y se refugió en otra especialidad, quizá su preferida, la hidráulica, y realizó un proyecto de secado de las Lagunas Pontinas, que pertenecían al duque Juliano II de Médicis. En 1514, realizó la serie de los Diluvios, que fue una respuesta parcial a la gran obra que Miguel Ángel desarrolló en la bóveda de la Capilla Sixtina.
«Los Médici me han creado, los Médici me han destruido», escribió Leonardo, sin duda para subrayar las decepciones de su estancia en Roma. Pensó que nunca se le dejaría mostrar su capacidad con la realización de un encargo importante. Probablemente también era conocida su inestabilidad, su fácil desánimo y su dificultad para finalizar lo que había empezado
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